Guillaume Gallienne est né le 8 février 1972 à Neuilly-sur-Seine. Il a vécu avec ses frères dans une famille de la haute bourgeoisie parisienne. Sa mère est issue de l’aristocratie russo-géorgienne et son père est un homme d’affaires. Après des études secondaires dans un pensionnat anglais, il revient en France et entame des études d’histoire. Parallèlement il s’inscrit au cours Florent à 18 ans puis il est admis au Conservatoire national supérieur d’art dramatique où il a entre autres pour professeur Daniel Mesguich.
Il intègre la Comédie-Française le 1er juillet 1998 au sein de laquelle il interprète les grands rôles du répertoire, il en devient Sociétaire le 1er janvier 2005. Parallèlement il obtient au cinéma des petits rôles puis on le remarque dans des comédies grand public comme Jet Set,Fauteuils d’orchestre, Astérix et Obélix : Au service de Sa Majesté mais aussi des films d’auteurs comme Tu vas rire, mais je te quitte de Philippe Harel, Le Concert de Radu Mihaileanu et même des productions étrangères comme Marie-Antoinette de Sofia Coppola.

Sa popularité éclate en 2008, avec la création d’un spectacle autobiographique Les Garçons et Guillaume, à table ! dans lequel il revient avec humour sur son enfance et l’éducation qu’il a reçue (notamment sa difficulté pour exister en tant que garçon dans sa famille). Il obtiendra d’ailleurs une pluie de récompenses pour cette pièce où il joue tous les personnages. De ce succès, il en fera, en 2013, un film du même nom.

2013 Les garçons et Guillaume, à table !